Stała ekspozycja mieści się w domu rodzinnym Jana Matejki (1838-1893) najwybitniejszego polskiego malarza nurtu historyzmu, kolekcjonera, miłośnika zabytków w szczególności Krakowa.
Stara, krakowska kamienica (przebudowywana w XVIII i XIX w.) jest miejscem, w którym urodził się, mieszkał z rodziną, tworzył i zmarł Jan Matejko.
  
Po śmierci artysty zawiązało się Towarzystwo jego imienia, które postawiło sobie za cel uczczenie osoby wybitnego malarza tworząc muzeum biograficzne jemu poświęcone. Dużym nakładem sił, w wykupionym od rodziny domu zgromadzono drogą systematycznych zakupów i darów różnorodne eksponaty związane z postacią Jana Matejki i jego rodziny, prezentując je po raz pierwszy publiczności już w 1898 roku.

W 1904 r. Towarzystwo im. Jana Matejki przekazało utworzone przez siebie muzeum biograficzne pod zarząd Muzeum Narodowego w Krakowie. Dziś zbiory Domu Jana Matejki liczą około 6000 eksponatów.
Znajdują się w nich przedmioty codziennego użytku i pamiątki po artyście i jego najbliższych: żonie Teodorze z Giebułtowskich Matejkowej (1846-1896), dzieciach: Tadeuszu (1865-1911), Helenie Unierzyskiej (1867-1932), Beacie Kirchmayerowej (1869-1926), Jerzym (1873-1827) i Reginie (1878-1878).
Zbiory obejmują listy, oficjalne dokumenty, pamiątki jubileuszowe, wyrazy uznania, a przede wszystkim prace olejne i rysunkowe, obiekty z kolekcji Matejki, którą gromadził przez całe życie, dzieła innych twórców, fotografie rodzinne oraz wykonane w XIX wieku fotografie obrazów mistrza oraz należący do niego zbiór książek i nut.

Dom Jana Matejki popularyzuje nieznane aspekty życia i twórczości artysty, jak również jego bogate zbiory rzemiosła, tkanin i militariów. Służą temu: stała ekspozycja, liczne wystawy czasowe w samym oddziale jak również na terenie całej Polski dzięki współpracy z licznymi ośrodkami muzealnymi z kraju i zagranicy.
Na terenie oddziału prowadzona jest także działalność edukacyjno-oświatowa: lekcje muzealne, warsztaty plastyczne dla dzieci oraz cykl wykładów „Czwartki u Matejków”.

Stała ekspozycja jest częścią Działu IX – Zbiory Jana Matejki.

Dział IX – Zbiory Jana Matejki zawierają eksponaty, które wiążą się z osobą artysty i jego twórczością. W dużej części jest to kolekcja rzemiosła artystycznego, tkanin, broni i zbiorów etnograficznych, którą artysta gromadził przez całe życie.

         Jan Matejko jest kojarzony przede wszystkim jako autor wielkich płócien o tematyce historycznej, rzadziej portretów. Wiele z nich można oglądać w Galerii Sztuki Polskiej XIX w. w Sukiennicach. Natomiast w Domu Jana Matejki znajdują się prace reprezentujące wszystkie fazy twórczości: od młodzieńczych realizacji (np. „Martwa natura”, 1852; „Widok z Wieży Ratuszowej w Krakowie”, 1857) po te ostatnie („Carowie Szujscy na sejmie warszawskim”, 1892). Wiele eksponatów wiąże się z kolejnymi etapami pracy twórczej artysty. Są tu niewielkie kompozycje historyczne, szkice do wielkich płócien, wizerunki postaci historycznych. Ważne miejsce zajmują portrety rodziny i przyjaciół m.in. pozyskane w ostatnich latach: „Portret Pauliny Giebułtowskiej” (1862)- teściowej artysty oraz jego siostry „Portret Marii Golichowskiej” (1882). Do najcenniejszych obrazów należą: „Wnętrze grobu Kazimierza Wielkiego” (1869), „Mikołaj Kopernik czyli rozmowa z Bogiem” (1871), „Jan II Sobieski wręcza kanonikowi Denhoffowi list do papieża z wiadomością o zwycięstwie nad Turkami pod Wiedniem w r. 1683” (1880), „Autoportret” (1887) i wiele innych.

         Cenny zbiór rysunków został pogrupowany tematycznie na: szkice do kompozycji historycznych, studia portretowe, kostiumowe, architektoniczne, krajobrazowe oraz rzemiosła artystycznego. Szczególne miejsce zajmują karykatury rodzinne oraz akwarele o tematyce historycznej.

         Przechowywane są także liczne kartony projektowe polichromii do kościoła Mariackiego w Krakowie, nad którą Matejko pracował w latach 1889-1891. Realizacja ta przyczyniła się do odnowienia zainteresowań malarstwem ściennym w twórczości jego uczniów: Stanisława Wyspiańskiego i Józefa Mehhofera.

Wyrazem uznania dla osiągnięć malarza są liczne polskie i zagraniczne medale, dyplomy, świadectwa przynależności do stowarzyszeń artystycznych i naukowych, różnego rodzaju akty hołdownicze sławiące wielkość Jana Matejki, a zwłaszcza „berło panowania w sztuce” wręczone mu przez Radę Miasta Krakowa w 1878 roku.

         Do najcenniejszych dokumentów rodzinnych należą świadectwa szkolne Jana, legitymacja Akademii Sztuk Pięknych w Monachium (1859) akt zawarcia małżeństwa z Teodorą z Giebułtowskich, ich wspólny paszport wydany na wyjazd do Paryża w roku 1863, akt zgonu artysty.

         Obok listów Matejki do rodziny i przyjaciół znajdujemy także autografy osobistości okazjonalnie korespondujących z artystą (m.in. Henryka Sienkiewicza, Władysława Czartoryskiego, Jacka Malczewskiego, Stanisława Tarnowskiego czy Mikołaja Zyblikiewicza). Na uwagę zasługują rękopisy np. Izydora Jabłońskiego – przyjaciela i biografa Matejki).

         Twórcy muzeum zdawali sobie sprawę, że eksponowanie wszystkich prac mistrza w jednym miejscu jest niemożliwe, dlatego też gromadzili ich dokumentację fotograficzną (niektóre zdjęcia są jedynym śladem po zaginionych obrazach). Wiele fotografii pochodzi ze zbiorów artysty i znajduje się na nich autorski komentarz. Do najcenniejszych należą podobizny Jana Matejki, jego rodziny oraz osób, które pozowały mistrzowi.

         Kolekcjonerskich zainteresowań Matejki dowodzi zbiór wyrobów rzemiosła artystycznego, tkanin, ubiorów, militariów, które często posłużyły artyście jako rekwizyty w pracy nad obrazami. Wiele z nich ma znaczna wartość artystyczną i materialną. Do najciekawszych należą: krzyż z przełomu XIV/XV wieku, dalmatyka włoska z końca XV wieku, żupan Jana Daniłłowicza z XVII wieku, gobelin flamandzki z XVIII wieku z przedstawieniem anioła stróża oraz elementy ubioru żydowskiego z przełomu XVII i XVIII wieku. Można także podziwiać neorenesansowe meble z Wenecji, broń europejską i wschodnią oraz zbiór narzędzi tortur pozyskany przez Matejkę podczas renowacji wieży dawnego ratusza. Świadectwem silnego związki artysty z Krakowem są np. kopie regaliów Kazimierza Wielkiego wykonane według rysunku artysty, który był obecny podczas komisyjnego otwarcia grobu królewskiego. Natomiast ciekawym przykładem zabytkowego sprzętu ekspozycyjnego jest wypchany koń ustawiony w pracowni malarza, nabyty przez twórców muzeum prawdopodobnie pod koniec XIX wieku.

         W Domu Jana Matejki znajdują się także obrazy, rysunki, rzeźby, ryciny oraz odlewy gipsowe prac innych artystów gromadzone przez malarza (najcenniejsze to dwa tryptyki z XV i XVI wieku oraz portret Mikołaja Kopernika z wieku XVIII) lub ofiarowane do powstającego muzeum („Portret Cziczerina” Ilii Riepina, 1894; akwarela Paula Delaroche’a „Noc św. Bartłomieja”(1 poł. XIX w.), czy rysunek Henryka Siemiradzkiego Studium do obrazu „Wędrowny handlarz” (2 poł. XIX w).

         Ciekawostką są rysunki Teodory Matejkowej, jej szkicowniki i pierścionek zaręczynowy, rzeźba jeźdźca na koniu wykonana przez córkę artysty – Helenę, ponadto ryciny z obrazów Matejki służące jako ilustracje w czasopismach i inne przedmioty świadczące o recepcji dzieł Mistrza.

         Księgozbiór Jana Matejki obejmuje starodruki od XVI do XVIII wieku, wydawnictwa historyczno-artystyczne, często z dedykacjami dla artysty, czasopisma (m.in. „Kłosy”, „Tygodnik Ilustrowany”, „Przegląd Polski”). Są też prace dotyczące Jana Matejki wydane po jego śmierci, czyli po 1893 roku.